קבוצתו של לונג לי בבית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת פקין פרסמה מאמר בשם "מסלול מולקולרי של ייבוא קדם חלבון מיטוכונדריאלי דרך המסלול המולקולרי של ייבוא קדם חלבון מיטוכונדריאלי דרך קומפלקס העל של TOM-TIM23", שפורסם ב- Nature Structural & Molecular Biology. המחקר מדווח על תוצאות מבניות וביוכימיות של קומפלקס העל TOM-TIM23 שמתווך הובלה חלבון במיטוכונדריה, חושף מסלול חדש של ייבוא חלבון דרך קומפלקס TOM על פני הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ומגדיר מחדש את הרכב הליבה של קומפלקס הטרנספורטר TIM23 בפנים הפנימיים. קרום מיטוכונדריאלי.
כאחד האברונים החשובים ביותר בתאים איקריוטיים, המיטוכונדריה ממלאת תפקידים חשובים באספקת אנרגיה, מטבוליזם תוך תאי, הומאוסטזיס ואפופטוזיס. למיטוכונדריה יש מבנה של קרום שומנים דו-שכבתי פנימי וחיצוני ייחודי, עם יותר מ-1,000 חלבונים המופצים בתוכו. 99% מהחלבונים המיטוכונדריים מקודדים על ידי גנים ציטוסוליים, מסונתזים בריבוזומים בציטופלזמה, ומועברים על פני הממברנה למיטוכונדריה כדי לבצע את תפקידיהם. לכן, הובלת חלבוני המיטוכונדריה היא קריטית לשמירה וויסות פעילות המיטוכונדריה, ומוטציות בגנים קשורים קשורות קשר הדוק להתפתחות מחלות מטבוליות רבות וסוגי סרטן בבני אדם. הקבוצה של לי לונג עבדה על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם חלבונים מיטוכונדריאלים נכנסים למיטוכונדריה, ועבודה שפורסמה כוללת פתרון המסלול שבו חלבוני הממברנה המיטוכונדריה נכנסים לקרום הפנימי דרך קומפלקס התחבורה TIM22 (Zhang Y. et al Cell Research משנת 2021). תפקידו של קומפלקס העל TOM-TIM23 בהובלת חלבון המיטוכונדריאלי חשוב עוד יותר במחקר זה. קומפלקס העל הזה, המורכב מעשרות תת-יחידות חלבון, משתרע על פני קרומי המיטוכונדריה הדו-שכבתיים הפנימיים והחיצוניים ושולט על ההובלה של יותר מ-500 חלבונים מסיסים וממברניים במיטוכונדריה. במהלך 40 השנים האחרונות, חוקרים חקרו באופן נרחב ואינטנסיבי את יחידות המשנה הבודדות של מתחמי התחבורה TOM ו-TIM23. עם זאת, בשל האופי הדינמי מאוד של קומפלקס העל הזה, ההבנה של השאלה המרכזית כיצד תת-יחידות אלו מתאספות ליצירת מסלול הובלת החלבון עדיין מוגבלת מאוד, במיוחד עבור קומפלקס TIM23 בקרום האנדוזומלי, שבו הרכב הליבה יחידת התחבורה הייתה מאוד לא ברורה.
במחקר זה, המחברים התחילו לראשונה בהרכבה של קומפלקס על TOM-TIM23 יציב, חקרו תוכניות הרכבה שונות, ולבסוף בחרו למזג חלבון פלואורסצנטי ירוק עם חלבון מיטוכונדריאלי כמצע התחבורה, ותפסו את מצב הביניים של TOM-TIM23 קומפלקס סופר להובלת מצעי חלבון בתאי שמרים. לאחר טיהור מבחנה, עדיין ניתן היה לייצב מצב ביניים זה למחקרי ביולוגיה מבניים וביוכימיה נוספים. על ידי ניתוח חלקיק בודד של מצב ביניים זה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון, המחברים מצאו כי ישנה אינטראקציה ישירה בין קומפלקס TOM הממוקם בקרום החיצוני לקומפלקס TIM23 הממוקם בממברנה הפנימית, ומקשר בין הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית והחיצונית. , אשר מספקת ביעילות את מצע החלבון מהממברנה החיצונית של המיטוכונדריה אל הממברנה הפנימית (איור 1א). בפרט, מתחם TOM נפתר לרזולוציה של 4.1 Å. המבנה חשף "מסלול חומצות אמינו קוטבי" בתוך הדופן הפנימית של תת-היחידה של ערוץ Tom40, אשר נשמר על פני מינים ומתווך את המעבר של מצע החלבון דרך נקבובית הביניים Tom40 בצורה לא מקופלת (איור 1b). מסלול זה שונה משני המסלולים הטרנסממברניים ב-Tom40 שהוצעו בעבר בהתבסס על ניסויים ביוכימיים, המדגימים את הרבגוניות של קומפלקס TOM בזיהוי יעיל והובלה של חלבונים מיטוכונדריאליים שונים.
איור 1. מבנה של קומפלקס העל TOM-TIM23. (א) הרכבה סכמטית ומבנה מיקרוסקופ קריו-אלקטרון של קומפלקס העל TOM-TIM23. (ב) מודל מבני של קריו-אלקטרון של קומפלקס TOM המכיל את מצע החלבון. (ג) מודל מבני AlphaFold2 של ההטרוטרימר Tim17-Tim23-Mgr2
בנוסף, המחברים הציגו באופן שיטתי חומצות אמינו לא טבעיות באתרים שונים של מצע החלבון ובדקו את סביבת מצע החלבון במסלול ההובלה של TOM-TIM23 באמצעות photocrosslinking, ובכך זיהו את תת-היחידה הליבה שעוזרת ישירות למצע לחצות את שני ממברנות שומנים. תוצאות הניסוי הראו שהקטע C-terminal של מצע החלבון יכול להצליב עם תת-יחידת ה-Tom40 של הממברנה החיצונית, תוצאה שעולה בקנה אחד עם תצפיות מבניות. עם זאת, באופן מפתיע, המקטע ה-N-טרמינלי של מצע החלבון צולב עם יחידות המשנה Tim17 ו-Mgr2 בממברנה הפנימית, אך לא עם תת-היחידה Tim23, שבדרך כלל מזוהה כמרכיבה את תעלת ההובלה של הממברנה הפנימית. תוצאה זו מעידה על כך שקיימת הטיה משמעותית בתפיסת מסלול התחבורה הליבה של מתחם TIM23 במחקרים קודמים. כדי לזהות עוד יותר את תת-היחידות והמסלולים של טרנספורטר הליבה ב-TIM23, המחברים השתמשו בשילוב של מודלים של AlphaFold2, קישור צולב ביוכימי, גנטיקה של שמרים והובלה חוץ גופית של חלבונים מיטוכונדריאליים, ומצאו שמרכיב הליבה של קומפלקס TIM23 הוא הטרוטרימר. המורכב מתת-יחידות Tim23, Tim17 ו-Mgr2, כאשר Tim17 ו-Mgr2 פנים אל פנים יוצרים מבנה דמוי תעלה, בעוד Tim23 נקשר ל-Tim17 בצורה גב אל גב ואינו מעורב ביצירת תעלות (איור 1c ). במהלך טרנסלוקציה של חלבון, מצע החלבון עובר דרך המבנה דמוי התעלה שנוצר על ידי Tim17 ו-Mgr2 ואינו יוצר קשר ישיר עם תת-היחידה Tim23. ניסויים של מוטגנזה גילו כי נפילה של Mgr2 בשמרים לא השפיעה על טרנסלוקציה של חלבון, מה שמצביע על כך שרק Tim17 נדרש במבנה דמוי התעלה שנוצרו על ידי Tim17 ו-Mgr2. הסיבה שבגללה Tim17 יכול לעזור לחלבונים לחצות את הממברנה האנדוזומלית נובעת מהייחודי שלו. התפלגות חומצות אמינו על פני השטח: מצד אחד, ל-Tim17 יש אזור בעל מטען שלילי שמור מאוד בכניסה של הממברנה האנדוזומלית שיכול לשבש את הממברנה המקומית. , אשר יכול לשבש את מבנה דו-שכבת הפוספוליפיד המקומי ולהוריד את מחסום האנרגיה לחלבונים לחצות את קרום השומנים; מצד שני, ל-Tim17 אזור הידרופובי שמור במרכז המסלול, שעוזר לשמור על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במצב אטום ולשמירה על פוטנציאל הממברנה הדרוש לפעילות פיזיולוגית של המיטוכונדריה. אם ניקח יחד את התוצאות של ניסויים מבניים וביוכימיים שונים, ניתן להסיק שקומפלקס TIM23, עם תת-היחידה Tim17 בליבתו, מאמץ מצב מעורב כדי לסייע בטרנסלוקציה של חלבון, כלומר, Tim17 יכול להיקשר באופן דינמי עם יחידות משנה אחרות כדי ליצור תעלה כדי לעזור לחלבונים על פני הממברנה, או Tim17 עובד במצב העבודה של אנזים החדרה כדי להשיג טרנסלוקציה של חלבון לבד ללא צורך ביצירת תעלות. תוצאה זו מתקנת את התפיסה השגויה בשטח ב-40 השנים האחרונות לפיה תת-יחידת ה-Tim23 מהווה ערוץ ליבה.
לסיכום, מחקר זה פיתח אסטרטגיה חדשה למחקרי הובלת חלבונים, חשף את המסלול הקריטי לחלבונים מיטוכונדריאליים לחצות את קרום השומנים הדו-שכבתי דרך קומפלקס העל TOM-TIM23 (איור 2), הפך את הידע רב השנים בתחום של מרכיבי הליבה של קומפלקס התחבורה TIM23 של הממברנה הפנימית, וגילה אופן חדש לחלוטין של פעולת אנזים הובלת חלבון, אשר מניח בסיס איתן להבנה מקיפה ומעמיקה של הביוסינתזה המיטוכונדריאלית. סינתזה, הנחת בסיס איתן להבנה מקיפה ומעמיקה של ביו-סינתזה של המיטוכונדריה.
איור 2. מסלול טרנספורטר מיטוכונדריאלי TOM-TIM23
לונג לי הוא המחבר המקביל של המאמר, ו-Xueyin Zhou, סטודנטית לדוקטורט מהכיתה המשותף של אוניברסיטת פקין-צינגואה למדעי החיים של 2018, Yuqi Yang, סטודנטית לדוקטורט מהכיתה של בית הספר למדעי החיים של 2019, Dr. פנג וואנג מפלטפורמת מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של אוניברסיטת פקין, ושאנשאן וואנג, סטודנטית לדוקטורט מבית הספר למדעי החיים של 2020, הם הכותבים הראשונים. דונג'י סאן, טכנאי לשעבר במעבדה של לי לונג, שיאומין או, דוקטורנט במכללה למדעי החיים, מחזור 2022, ויוקה ליאן, סטודנטית לדוקטורט במכללה למדעי החיים, מחזור 2021, תרמו תרומות משמעותיות המחקר הזה. פרופ' נינג גאו והחוקרת המשותפת נינגנינג לי מבית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת פקין, והחוקרת Xinzheng Zhang מהמכון לביופיזיקה, האקדמיה הסינית למדעים, סיפקו עזרה רבה בחישוב נתוני מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון, ופרופ' צ'ינג לי ופרופ' רווח צ'אנג מבית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת פקין, סיפק הדרכה חשובה לגבי גנטיקה של שמרים וניסויים בצילום קרוסלינקציה, בהתאמה. עבודת המחקר נתמכה על ידי פלטפורמת מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של אוניברסיטת פקין, מרכז מיחשוב גבוה, מרכז המכשור של בית הספר למדעי החיים ופלטפורמת החלבון הלאומית של פניקס, ומומנה על ידי מעבדת המפתח הממלכתית לביולוגיה ממברנה, המרכז המשותף של אוניברסיטת פקין-צינגואה למדעי החיים והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין.
